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一株植物乳杆菌的分离鉴定及特性研究
作者:   时间:2012-10-27

 


 辛国芹1,辛国民2,徐海燕1*,武香玉1,张志焱1,谢全喜1
(1.山东宝来利来生物工程股份有限公司 山东泰安 271000;2.安丘市畜牧局 山东安丘 262114)

  摘要:从泡菜中富集培养分离到12株乳酸菌,经测定发酵液pH值筛选到一株产酸性能较好的菌株PS-9,结合菌落形态特征、生理生化特性及菌株特异性序列分析等手段,确定其分类归属,并对其特性进行了研究。结果表明PS-9为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。菌株PS-9在pH值2.0环境中的存活率为85.2%,胆盐浓度0.4%环境中存活率为37.2%,对鸡大肠杆菌O78和金黄色葡萄球菌C56011的抑菌圈直径均超过18mm。
  关键词:分离鉴定 生物学特性 系统发育分析 植物乳杆菌

Isolation and Identification of Lactobacillus plantarum Strain and Studies on Bio-character

XIN Guo-qin1,XIN Guo-min2,XU Hai-yan1,WU Xiang-yu1,ZHANG Zhi-yan1,XIE Quan-xi1
(Shandong Baolai-leelai Bioengineering Co.,Ltd.Taian 271000,China; Anqiu City Bureau of Animal Husbandry,Anqiu 262114,China)
  Abstract:Twelve strains of Lactic Acid Bacteria were isolated from pickles by the richment culture method. A strain PS-9 with better acid-forming performance was screened by determination of pH value of the fermentation liquor.It was identified as Lactobacillus plantarum by based on physiological, biochemical characteristics and 16S rDNA sequence phylogeny analysis. The results showed that the strain had distinct acid and bile salt resistance, the survival rate was 85.2% and 37.2% respectively when it was inoculated in MRS broth with pH 2.0 and bile salt 0.4% concentration.The diameters of inhibitory zone were both longer than 18mm on Avian Escherichia coli 078 and Staphylococcal.
  Key words: isolation and identification; biological characteristics; phylogenetic analysis; Lactobacillus plantarum

  乳酸菌是一种安全、优质、高效的益生菌,其有助于胃肠道正常栖居菌的生长和定植, 直接或间接影响其它微生物种群,能显著减少大肠杆菌、梭状芽孢杆菌和沙门氏菌在肠道 内的定植。目前应用于饲料添加剂的乳酸菌主要有植物乳杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪链球菌等[1-2]。乳酸菌是乳制品、泡菜、发酵香肠等传统发酵食品的主要发酵剂[3], 同时还是促进青贮饲料发酵、酸化成熟有益菌群。泡菜作为一种传统的乳酸菌发酵制品,其汁液中富含乳酸菌活菌,其中尤以短乳杆菌和植物乳杆菌占优势。目前。筛选对微生物发酵饲料有益的菌种已经成为发展趋势,选择生长性能好、产酸能力强的优良菌株尤为重要。为此对泡菜中产酸性能好的菌株进行了筛选及特性研究,以期为优良菌株的筛选提供基础,为乳酸菌在食品、生物制品中的进一步应用提供依据。
1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1泡菜样品
  购自山东省泰安市超市。采集市售泡菜样品于无菌取样袋中,封好放入冰盒内,带回实验室于4 ℃冰箱中保存,尽快进行乳酸菌的分离。
1.1.2 指示菌
  鸡大肠杆菌O78,金黄色葡萄球菌C56011均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
1.1.3培养基
  改良MRS培养基[4]、明胶液化培养基、吲哚试验培养基、产硫化氢培养基等均采用文献[5]中的培养基配方进行配制。
1.1.4其它试剂
  本研究中所需其它试剂及溶液均按常规自行配制
1.2 分离纯化
  取适量泡菜至80mL MRS培养基中37℃富集培养20h,取培养液于含CaCO3的MRS琼脂培养基上划线,37℃恒温静止培养24h后,挑取培养基上具有明显透明圈的单菌落,经革兰氏染色和接触酶反应,挑出革兰氏染色阳性、接触酶阴性菌株斜面保存。
1.3目的菌株的液体培养及生长曲线的确定
  将产酸性能好的目的菌株以2%接种量接种到于改良的MRS培养基中,37℃静置培养,于0h、4h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、22h、24h、28h、32h取样测定pH值以及活菌数,以培养时间为横坐标,相应的活菌数的对数值为纵坐标,绘制生长曲线,找出最适培养时间。从而确定菌株生长的各个阶段。并取处于稳定生长期的液体菌种作为种子液,进行后续试验。
1.4产酸性能的测定
  将各菌株种子液分别以1%接种量接种到初始pH值一致的MRS培养基中,37℃静置培养20h,测定发酵液的pH值,选取发酵液pH值较低的菌株进行后续试验。
1.5菌株的鉴定
1.5.1生理生化鉴定
  根据分离菌的菌落和菌体形态,革兰氏染色以及生理生化反应,按《伯杰氏细菌鉴定手册》进行初步归属。
1.5.2 16S rDNA的扩增与序列分析
  目的菌株接种于新鲜的MRS培养基中培养20h,采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA,并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物:1492r 5’-ggttaccttgttacgactt-3’ 27f 5’-agagttgatcctggctcag-3’,PCR反应体系(50μL)为: Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等,天根生化科技有限公司),上下游引物各1μL,模板DNA 2μL,超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,52℃退火1min,72℃延伸2min,25个循环,72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。
1.5.3系统发育分析
  登录GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对菌株16S rDNA测序结果利用Blast进行检索,并下载相关属种的16S rDNA序列,采用DNAMAN、DNAclub、MEGA3.1等软件进行同源性分析,并构建系统进化树。
1.6 耐酸性试验
  取发酵20h的菌液10mL,3000r/min离心15min,弃上清,将菌体用生理盐水洗涤3次,先加人生理盐水5mL,10mol/L的盐酸调节乳酸菌的菌悬液的pH值分别为2.0、3.0、4.0,然后用生理盐水定容至10mL,于37℃处理2h。取菌悬液,在平皿上作菌落计数,从而计算出乳酸菌的存活率,以pH 5.5~6.0的菌液为对照。
存活率(%)=待测pH的菌液活菌数/pH 5.5~6.0的菌液活菌数×100。
1.7耐胆盐试验
  菌液按5%(v/v)接种于胆盐浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%(w/v)的MRS培养基中,以不加胆盐的MRS培养基为对照,37℃培养30min,取样进行平板菌落计数,计算乳酸菌存活率。
1.8 抑菌试验
  将纯菌培养液以40000r/min离心30min,取其上清液。采用钢圈法做抑菌试验。将大肠杆菌O78及金黄色葡萄球菌C56011分别涂布于营养琼脂平板上,每皿均匀内置无菌钢圈3个,在其中两个钢圈内加满上清液,另一钢圈内加入灭菌生理盐水作对照。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离筛选
  从市售泡菜中富集分离得到12株细菌菌株,测其发酵液的pH值,结果如表1所示。
表1 菌株pH值的测定结果
菌株编号
发酵液pH值
菌株编号
发酵液pH值
空白
6.5
PS-7
3.98
PS-1
3.78
PS-8
4.14
PS2
3.84
PS-9
3.17
PS-3
3.97
PC-1
3.8
PS-4
4.12
PC-2
4.16
PS-5
3.86
PC-3
3.91
PS-6
3.86
 
 
  由表1可以看出所分离的菌株中,菌株PS-9的培养液经发酵后pH值降低为3.17,明显低于其它菌株发酵液的pH值,说明产酸性能较好。
2.2 菌株的鉴定
2.2.1 菌株PS-9的生长曲线
  菌株PS-9的生长曲线如图1所示。


图1 菌株PS-9的生长曲线
  由图1可以看出,在2~10h内菌体生长迅速,在4h左右进入对数期,随后进入稳定期,且持续时间较长,并在22h时活菌数达到最大值2.62×109 cfu/ml。菌体在稳定期内各生长因素达到最高值,故选择培养时间为22h的菌液作为种子液进行后续试验。
2.2.2 菌株PS-9的生理生化特性
  菌株PS-9在MRS琼脂培养基上生长22h,形成明显乳白色、圆形菌落(如图2),中央凸起,边缘光滑,具一定的黏性。显微镜下观察呈杆状,两端钝圆,革兰氏染色阳性(如图3)。

图2 PS-9的菌落培养性状 图3 PS-9的菌体形态(油镜观察)
  主要生理生化性质测试结果如表2和3所示。
表 2 菌株PS-9糖发酵试验结果
发酵糖类
PS-9
发酵糖类
PS-9
发酵糖类
PS-9
葡萄糖
+
半乳糖
+
甘油
+
麦芽糖
+
甘露糖
+
海藻糖
+
乳糖
+
淀粉
+
棉籽糖
+
蔗糖
+
木糖
+
阿拉伯糖
果糖
+
鼠李糖
 
 
  注:“+” 为阳性反应,“—” 为阴性反应

试验
项目
接触酶
试验
乙酸氧化试验
明胶液化试验
硝酸盐
还原试验
产H2S
试验
吲哚
试验
结果
  注:“—” 为阴性反应
  根据上述生理生化特性及形态特征,参考《常见细菌系统鉴定手册》,本试验中分离得到的菌株PS-9与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum )基本相同,因此将该菌株初步鉴定为植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum )。
2.2.3 菌株PS-9的16S rDNA序列分析

  图4 菌株PS-9 PCR扩增产物琼脂凝胶电泳结果
M:Marker DL2000 1、2:菌株PS-9 PCR产物

图5菌株PS-9的系统进化分析
  从图5中可知菌株PS-9与Lactobacillus plantarum自然聚为一支,经过同源性比对发现菌株PS-9的与 Lactobacillus planttarum的16S rDNA序列同源性超过99%。一般来讲 ,在种分类等级上,如果2个分类单位间的16S rDNA序列同源性大于97.5% ,则认为属于同一个种[6-7]。综合菌株PS-9的生理生化特点及16S rDNA系统进化分析,确定该菌株为乳杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
2.3耐酸性试验
  菌株PS-9的耐酸性试验结果如表4所示
pH值
pH2.0
pH3.0
pH4.0
pH5.5
活菌数(×108cfu/mL)
7.5
8.0
8.6
8.8
存活率(%)
85.2
90.9
97.7
  由表4可以看出菌株PS-9在pH值2.0、3.0、4.0时的存活率分别为85.2%、90.9%、97.7%,说明该菌具有较强的耐酸性。
2.4 耐胆盐试验

  图5 菌株PS-9对胆盐耐性性结果
  益生菌只有能耐受一定的胆盐浓度,才能在肠道内定植[8]。由图5看出菌株PS-9在胆盐浓度为0.1%环境中存活率为100%,随着胆盐浓度的增大存活率明显下降,在胆盐浓度0.3%时,存活率为54.7%,其存活率超过50%, 因此能够在肠道内增殖。在胆盐浓度为0.4%时存活率仍可达到37.2%,由此可以看出菌株PS-9具较好的耐胆盐效果。
2.5抑菌试验结果
  菌株PS-9对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制结果如表5所示
表5 菌株PS-9发酵液对致病菌的抑制试验结果(Φ:mm)
项目
金黄色葡萄球菌C56011
S.aureus
鸡大肠杆菌O78
E.coli
对照(CK)
8.0
8.0
PS-9
20±0.5
19±0.5
  注:该菌上清液对鸡大肠杆菌O78金黄色葡萄球菌C56011抑菌圈直径均大于18 mm。
由结果可以看出,菌株PS-9对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制效果,其对金黄色葡萄球菌的抑制效果好于对大肠杆菌的抑制效果,
3 结论与讨论
  3.1 从市售泡菜中利用平板筛选法初步分离出12株乳酸菌,经测定发酵液pH值对其产酸性能进行测试,筛选出1株产酸性能好的菌株PS-9,结合该菌株的菌落形态特征、生理生化性质和16S rDNA序列同源性分析等试验结果可知,分离的菌株PS-9鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum), 该菌株在pH值2.0、3.0、4.0时的存活率分别为85.2%、90.9%、97.7%;胆盐浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%环境时存活率分别是100%、77.9%、54.7%、37.2%;对鸡大肠杆菌O78和金黄色葡萄球菌C56011的抑菌圈直径均超过18 mm。
  3.2 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)也是人体胃肠道的益生菌群,代谢可以产生多种抑菌物质,能够调节肠道微生物菌群平衡,增强机体免疫力,降低胆固醇水平,缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等[9]。胃肠道作为动物的一个消化吸收的重要器官,其微生物区系的平衡对维持动物机体的健康起着重要的作用。益生菌经口服进入动物机体,必须先经过胃然后到小肠定植,因此,益生菌只有能够抵抗较强的酸性环境和较高浓度的胆盐才能使其在肠道中存活和正常发挥作用。本研究筛选的菌株PS-9在pH值为2时存活率为85.2%,胆盐浓度为0.4%时存活率为37.2%,说明该菌株具有较强的耐酸和耐胆盐能力。此外,菌株PS-9对鸡大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具明显的抑制效果,可作为优良的益生菌候选菌.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是我国卫生部公布的《可用于生产普通食品的菌种名单》中的菌种,因此本研究所获得的PS-9具有作为益生菌的良好潜质。
参考文献
  [1] Predigon C.Immune adjuvant activity of oral Lacto-bacillus:influence of close in the secretory immune res-ponse and protective capacity in intestinal infestions[J].J Dairy sci,1991,58:485.
  [2] 赵红霞,詹 勇,许梓荣.乳酸菌的研究及其应用[J].江西饲料,2003,1:9-12.
  [3] Hansen E.B.Commercial bacterial starler cultures for fermentled fods of the future.Int.J.Food Microbiol.,2002,78(1/2):119-131.
  [4] 张刚.乳酸细菌基础、技术和应用[M].北京:化学工业出版社, 2007:421- 442.
  [5] 刘慧.现代食品微生物学试验技术[M].北京:中国轻工业出版社, 2006: 262-265.
  [6] CLAYTON R A, SUTTON G, H NKLE P S, et al.Intra specific variation in small-subun it 16S rRNA sequences in GenBank: why single sequences may not adequately represent prokaryotic taxa[J].Int JSyst Bcateriol,1995,45 (3):595-599.
  [7] KOLBERT C P, PERSNG D H. Ribo somal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens [J]. Curr Micro-biol,1992, 2 (3) :229-305.
  [8] Chou L, Weimer B.Isolation and Characterization of Acid and Bile- tolerant Isolate from Strains of Lactobacillus Acidophilus[J]. Dairy Sci,1999, 82 (1):23-31
  [9] 李 疆,周海珍,李开雄.SAS软件优化植物乳杆菌增殖培养基的研究[J].食品研究与开发, 2007,28 (6):416-420.





 

 

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