宝来利来
       企业文化
      
       新闻中心
       产品中心原
       生物研究院
       数据中心
       客户服务
       图解
       2010年春节
       2010年厂庆
       幻灯片图片
       峰会内容备份
       近期会讯
       图说宝来利来
       产品试验
       论文集绵
       事业部
       产品中心
       English
    首页>>论文集绵

富铁酵母发酵条件优化的研究
作者:   时间:2012-10-26

 


 徐海燕* 张志焱 谷巍
(山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东 泰安 271000)

   摘要:利用酵母菌具有较强的富集微量元素的特性,试验对酵母菌富集微量元素铁的条件进行了优化。从7株酵母菌中筛选出耐铁能力和富集铁能力均较强的CRJ3作为试验菌株。试验结果表明:500mL三角瓶中装入75mL发酵培养基,pH值为5.0,接种量为2%,在28-30℃,180r/min条件下摇床培养,采用硫酸亚铁作为铁源,适宜的FeSO4•7H20浓度为800µg/mL。在此条件下培养所得的酵母菌体生物量能达到1.30 g/100mL,铁含量能达到35mg/g左右,转化率达到56.0%。同时CRJ3菌株发酵罐培养采用恒定pH值发酵,酵母菌体生物量能达到1.45 g/100mL,总铁含量能达到500mg/L左右,有机化程度约为98%。
关键词:富铁酵母;发酵条件;生物量;铁含量
Study on the fermentation conditions of iron-enriched yeast
XU Hai-yan*,Zhang Zhi-yan, GU Wei
(Shandong BaoLai-LeeLai Bioengineering Co. Ltd, Taian , Shandong, 271000, China)
Abstract:The use of yeast has strong characteristics of enrichment of trace elements,the experiment has studied the conditions optimization of yeast iron-rich.Selected the CRJ3 with strong iron -resistantand iron -rich ability from seven yeast as a pilot.The result show that encase 75 mL culture medium in 500 mL bottles,the pH is 5.0,the inoculum is 2%,the rotation is 180 r/min,cultivated in shaker on 28-30℃.The best concentration is 800µg/mL FeSO4•7H20. The biomass can achieve 1.30 g/100mL ,the iron chromium capaicity can be achieved 35 mg/g about,and 56.0% of conversion . The CRJ3 strains was cultured by using a constant pH value of fermentation in the fermentor. The biomass can achieve 1.45 g/100mL ,the total iron capaicity can be achieved 500mg/L about with 98% of iron being organic about.
Key words:iron-enriched yeast;fermentation conditions;biomass;iron content
铁是人及动物必需的微量元素之一,是构成血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素酶体系的辅基和过氧化氢酶的组成成分,在组织呼吸与生物氧化过程中起重要作用[1]。缺铁可导致机体内多种含铁酶活力降低,可使机体的抵抗力降低,并诱发多种疾病,如贫血性心脏病、舌炎、口角炎、皮肤干燥、指甲变形及各种感染性疾病和癌症等[2] 。自然界中虽然含有丰富的铁元素,但多以不溶性铁盐的形式存在[3-4] 。目前,国内在饲料中使用的铁元素主要以无机制剂形态添加,由于这些制剂在储存或消化过程中会被酸化,使Fe2+变成难吸收的Fe3+[5]。无机铁与有机铁相比具有不容易吸收、对粘膜有刺激性、胃肠道副作用较大和不具有生物活性的特点[6]。因此研究低毒高效补铁剂一直是开发的方向。研究证实酵母是一种较为理想的微量元素载体[7-9] 。对于富铁酵母而言,其主要是利用酵母细胞吸收多、转化快的特性,使其作为微量元素的载体,在细胞内将无机铁化合物转化成有机形式,不但可以脱去传统食品强化剂中的不良因素、提高铁的利用率,还可提供大量的菌体蛋白、多肽、小肽、消化酶、氨基酸、丰富的B族维生素以及其他生物活性物质,其细胞壁还含有甘露寡糖,这些物质对人体健康都具有重要意义[10]。本试验拟研究酵母菌富集微量元素铁的影响因素,并确定富铁酵母的最佳培养条件,为富铁酵母的发酵生产奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 菌种
5株产朊假丝酵母(Candida utilis),编号为CRJ1~CRJ5;2株啤酒酵母,编号为PJ1、PJ2:均由山东宝来利来生物产业集团生物研究院菌种保藏中心提供。
1.2 培养基
斜面培养基:PDA培养基。
种子培养基:10°Bx的麦芽汁培养基。取1份麦芽粉加5份水,65℃水浴中保温4h,使其糖化,直至糖化完全(检查方法是取0.5 mL的糖化液,加2-3滴碘液,如无蓝色出现,即表示糖化完全)。
发酵培养基(g/L):采用YPD培养基。葡萄糖40、蛋白胨10、酵母浸膏5、磷酸氢二钾2,pH值6.0。
1.3 主要试剂
硫酸亚铁、硫酸铁铵、硝酸铁、邻二氮菲、盐酸羟胺等均为分析纯。
1.4 主要仪器
高压灭菌锅,超净工作台,酸度计,超声波破碎仪,恒温培养箱,摇床,UV-2000紫外可见分光光度计,电子天平,高速离心机,电热板等。
1.5 方法
1.5.1 培养方法
1.5.1.1 液体种子
将活化好的斜面菌种接种于种子培养基(50mL/250mL三角瓶)中,28℃培养16h左右。
1.5.1.2 酵母细胞培养
将培养好的种子以5%的接种量接种到含有Fe2+的发酵培养基中,28℃、180r/min培养。其它培养条件由具体的试验确定。
1.5.2 分析方法
1.5.2.1 菌体生物量的测定
取一定体积发酵液5000 r/min离心20min,弃上清液,蒸馏水洗涤3次,最后收集菌体,60~70℃干燥后称重即得。
1.5.2.2 酵母细胞铁含量的测定
富铁酵母细胞发培养液5000 r/min离心20min,弃上清液,沉淀用蒸馏水冲洗3次后,收获菌体,干燥至恒重后,用于测定铁的含量,采用邻二氮菲比色法[11]。
(1)原理
在pH值2.0 ~9.0的范围内(一般选择pH3.0),邻二氮菲与Fe2+生成极稳定的橙红色配合物。在波长510nm下进行比色测定。
(2)标准曲线绘制
吸取10µg/mL铁标准使用液,0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL(相当于0、10、20、30、40、50µg铁),分别置于25mL刻度试管中,各加入10%的盐酸羟铵溶液1.00mL,0.15%的邻二氮菲溶液2.00mL,1mol/L醋酸钠溶液5.00mL,每加一种试剂后摇匀,然后,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀后放置10min,在波长510nm处测定吸光值。以铁含量为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
(3)样品处理—湿消化法
取适量样品于100mL三角瓶中,加硝酸10mL,在三角瓶顶部放小漏斗,在电热板上微火加热至发烟,稍冷却后,加入高氯酸3 mL继续加热,当溶液变为清亮无色并冒浓白烟时 (剩余体积2 mL左右,切不可蒸干)结束。将消化液转移到50mL具塞刻度试管中,并用蒸馏水定容至50mL,然后按照标准曲线的方法测定。
1.5.2.3 细胞破碎
将酵母菌悬液冰浴,用超声波破碎仪进行处理300次,每次工作4s,间隔5s。细胞破碎后,5000r/min离心20min。
1.5.2.4 富铁酵母中有机铁和无机铁的测定
收集培养后的酵母菌液,5000r/min离心20min后弃上清液,然后用蒸馏水冲洗沉淀,再离心,重复3次,最后收集菌体4℃冷藏备用。准确称取一定量冷藏备用的菌体配制为25mL悬浮液(加入相当于6倍菌体重的含1O%甘油,2Ommol/L MgC12•6H2 O,pH为8.6的0.1mol/LTris-HC1缓冲液),破碎细胞后得到上清液(包括无机铁和铁蛋白)。在上清液中加入60%固体硫酸铵粉末,轻微振荡5min后静置2h,5000r/min离心20min以沉降含铁蛋白。取上清液测定无机铁含量。沉降的细胞残片和含铁蛋白65℃烘干后,混匀,取样测定有机铁含量。
1.5.3 试验设计
1.5.3.1 菌种筛选
将7株试验菌株接入种子培养基中,28℃、180r/min振荡培养16h。以5%的接种量接种到含有600µg/mL Fe2+的YPD培养基中,28℃、180r/min振荡培养24h。收集菌体测定生物量和铁含量。
1.5.3.2 不同铁盐对铁富集的影响
选用几种常用的铁盐作为铁源,铁离子浓度均为400µg/mL。28℃、180r/min振荡培养36h后,测定生物量、酵母细胞内的铁含量、总铁含量及转化率。
1.5.3.3 铁离子浓度对富铁酵母的影响
将酵母接种到含铁离子0、200、400、600、800、1200、1600、2000µg/mL的发酵培养基中28℃振荡培养36h,测定其生物量、酵母细胞内的铁含量、总铁含量及转化率。
1.5.3.4 起始pH值对富铁酵母的影响
将发酵培养基的初始pH分别调为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,每500mL三角瓶装液量50mL,接种量2%,28℃振荡培养36h,测定其生物量、酵母细胞内的铁含量、总铁含量及转化率。
1.5.3.5接种量对富铁酵母的影响
在500mL三角瓶装入50mL发酵培养基,将液体种子按2%、4%、6%、8%、10%的量接入到上述培养基中,28℃振荡培养36h,测定其生物量、酵母细胞内的铁含量、总铁含量及转化率。
1.5.3.6 装液量对富铁酵母的影响
在500mL三角瓶中分别装入不同体积的发酵培养基,其它条件相同,28℃振荡培养36h,测定其生物量、酵母细胞内的铁含量、总铁含量及转化率。
1.5.3.7 不同加铁时间对富铁酵母的影响
在其他条件相同的情况下,分别在发酵0h、12h、18h、24h往培养基中加入硫酸亚铁至浓度为800Fe2+µg/mL,培养36小时结束,测定生物量、酵母细胞中铁的含量、总铁含量及转化率。
1.5.3.8 实验室发酵罐培养
富铁酵母菌株生长曲线的测定:在装有5.0L发酵培养基的7.0L机械搅拌发酵罐中,根据实验室三角瓶筛选出的最佳培养条件进行恒定pH值培养。
2 结果与分析
2.1 菌种筛选( 结果见表1)
表1 7株酵母菌富铁能力比较
Table 1. Comparison to iron -rich ability from seven yeast
菌种编号
生物量(g/100mL)
酵母细胞中的铁含量(µg/g)
总铁含量(mg/L)
转化率(%)
CRJ1
1.26
26333 331.8 55.7
CRJ2
1.26
24190 304.8 50.8
CRJ3
1.35
31200 421.2 70.2
CRJ4
1.20
31050 372.6 62.1
CRJ5
1.31
30137 394.8 65.8
PJ1
1.08
34500 372.6 62.1
PJ2
1.14
31737 361.8 60.3
  由表1可以看出,这7株酵母菌对铁的耐受能力均较强,产朊假丝酵母的生物量较高,均在1.20g/100mL以上,啤酒酵母的稍低,在1.00g/100mL以上。铁的转化率均在50%以上,酵母细胞中的铁含量均比较高,在25000µg/g以上,其中CRJ3的转化率最高,达到70.2%,酵母细胞中的铁含量达到31200µg/g,且总铁含量也最高,达到421.2mg/L。综合考虑,以CRJ3作为试验用菌株。
   2.2 不同铁盐对铁富集的影响(结果见表2)
表2 不同铁盐对铁富集的影响
Table 2. Effects of different iron-salts on iron-enrichment
铁源 硝酸铁 硫酸亚铁 三氯化铁 硫酸铁铵 硫酸铁
生物量(g/100mL) 1.37 1.39 1.39 1.33 1.33
酵母细胞中的铁含量(µg/g) 14586 21124 18085 12371 11707
总铁含量(mg/L) 199.8 293.6 251.4 164.5 155.8
转化率(%) 50.0 73.4 62.8 41.1 38.9
   由表2可见,在相同的培养条件下,菌株CRJ3细胞与各种铁化合物都能产生结合。并且试验所用的5种铁盐对其生物量的影响较小,但对铁的富集有较大的影响,其中硫酸亚铁作为铁源时,酵母细胞中的铁及总铁含量均最高,达到21124µg/g和293.6mg/L,转化率为73.4%,所以在后续的试验中采用硫酸亚铁作为铁源。
2.3 铁盐浓度对富铁酵母的影响(结果见表3)
表3 培养基中Fe2+添加量对富铁酵母的影响
Table 3.The effects of Fe2+ addition amount on iron-enriched yeast
Fe2+添加量(µg/mL) 0 400 600 800 1200 1600 2000
生物量(g/100mL) 1.32 1.35 1.35 1.32 1.12 0.45 0.42
酵母细胞中的铁含量(µg/g) 25390 32065 38490 45268 111558 118643
总铁含量(mg/L) 342.8 432.9 508.1 507.0 502.0 498.3
转化率(%) 85.7 72.1 63.5 42.3 31.4 24.9
   注:“—”表示未测出。
   在确定了上述优化条件下,研究了不同硫酸亚铁浓度下菌株CRJ3的细胞生物量及铁富集情况。由表3可以看出,铁盐浓度在0~800µg/mL范围变化时,菌株CRJ3的生长随着培养基中铁含量的增加而趋于平缓,且总铁含量在800µg/mL时达到最高,为508.1 mg/L;当起始浓度高于800µg/mL时,随着培养基中铁浓度的升高菌株的生长受到明显的抑制,但总铁含量差异不显著。综合考虑,确定培养基中起始铁浓度为800µg/mL。
2.4 起始pH值对富铁酵母的影响(结果见表4)
表4 起始pH值对富铁酵母的影响
Table 4.The effect of initial pH on iron-enriched yeast
培养基起始pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
生物量(g/100mL) 1.26 1.23 1.28 1.28 1.30 1.36 1.17 0.94
酵母细胞中的铁含量(µg/g) 36896 37221 39877 36990 33221 31080 25218 18560
总铁含量(mg/L) 464.9 457.8 510.4 473.5 431.9 422.7 295.1 174.5
转化率(%) 58.1 57.2 63.8 59.2 54.0 52.8 36.9 21.8
   由表4可知,pH值对酵母的生长影响较大,即弱酸性条件有利于酵母菌的生长,而中性偏碱的环境不利用酵母菌的生长;同时对铁的富集也有较大的影响。   pH明显影响了酵母的生长和代谢,进而影响了生物量的累积及铁的富集。在pH6.5时,生物量达到最大,为1.36 g/100mL,但酵母细胞中铁含量、总铁含量及转化率在pH5.0时达到最高,分别为39877µg/g、510.4mg/L和63.8%。综合考虑,确定富铁酵母的最佳发酵起始pH值为5.0。
2.5 接种量对富铁酵母的影响(结果见表5)
表5 接种量对富铁酵母的影响
Table 5. The effects of inoculum on iron-enriched yeast
接种量(%)
2
4
6
8
10
生物量(g/100mL)
1.32
1.34
1.39
1.30
1.21
酵母细胞中的铁含量(µg/g)
34364
31402
27913
26277
26711
总铁含量(mg/L)
453.2
420.8
388.0
341.6
323.2
转化率(%)
56.7
52.6
48.5
42.7
40.4
   由表5可以看出,接种量对酵母铁的生物量及铁含量、转化率都有较大的影响,接种量过大,抑制了生物量的累积及铁的富集;接种量为6%时,生物量达到了最大,为1.39g/100mL,,接种量为2%时,酵母细胞中铁含量、总铁含量及转化率均最高,分别为34364µg/g、453.2mg/L和56.7%。综合考虑,确定接种量为2%。
2.6 装液量对富铁酵母的影响(结果见表6)
表6 装液量对富铁酵母的影响
Table 6. .The effect of culture medium volume on on iron-enriched yeast
接种量(%)
25
50
75
100
125
生物量(g/100mL)
1.25
1.25
1.23
1.02
0.97
酵母细胞中的铁含量(µg/g) 28980 31298 33345 27643 23835
总铁含量(mg/L) 362.2 391.2 410.4 282.0 231.2
转化率(%) 45.3 48.9 51.3 35.2 28.9
   本实验利用不同的装液量模拟溶解氧条件的影响。由试验结果可知,装液量对菌株CRJ3的生物量及铁的富集有较大的影响。装液量在75mL/500mL三角瓶时,总铁含量及转化率均达到最大,分别为410.4 mg/L和51.3%。
2.7 不同加铁时间对富铁酵母的影响(结果见表7)
表7 不同加铁时间对富铁酵母的影响
加铁盐时间(h)
0
12
18
24
生物量(g/100mL)
1.30
1.31
1.33
1.47
酵母细胞中的铁含量(µg/g)
34988
26764
15519
6465
总铁含量(mg/L)
454.8
350.6
206.4
95.0
转化率(%)
56.9
43.8
25.8
11.9
   在发酵培养基和培养条件优化的基础上,为了确定最佳铁盐的加入时间,从而诱导细胞获得较高的总铁含量。试验在不同发酵时间加入800µg/mLFe2+ 。表7结果显示,随着加铁时间的延迟富铁酵母的生物量呈递增趋势,但酵母细胞中的铁含量、总铁含量及转化率随加铁时间的延迟大大降低。因此在开始发酵的同时即加入硫酸亚铁,可使细胞中铁含量、总铁含量及转化率分别达到34988µg/g、454.8 mg/L和56.9%。
2.8 实验室发酵罐培养
   按2%的接种量接种,在初始培养基中加入硫酸亚铁使Fe2+浓度达到800µg/mL,在28-30℃,初始转速为180r/min、罐压0.05 MPa下进行恒定pH值培养,pH值定为5.0。主要是根据培养基pH值的变化流加NaOH溶液,当pH值低于4.0时,加入碱液使pH值升高至5.0。发酵过程中每2 h时取样一次,测定发酵液的生物量以及铁含量。以酵母菌的生物量和总铁含量为纵坐标、培养时间为横坐标,绘出所筛选富铁酵母菌株CRJ3的生长曲线。结果见图1。



图1 菌株CRJ3的生长曲线及铁富集曲线
Figure 1.The growth curve and iron enrichment of CRJ3 strains
   由图1可知,在优化发酵条件下,该菌株在0~6h处于延滞期,从6h以后进入对数生长期,在24 h生物量达到最大,至34 h生物量保持在一个相对稳定的数值。随着发酵时间的延长,总铁含量呈上升趋势,至24h达到最高,之后总铁含量有下降趋势。从规模生产上考虑,发酵时间可以控制在24h左右。通过对CRJ3菌株在液体培养基中的生长及富铁状况的研究,为该菌株的工业化生产提供了依据。
在上述优化发酵条件下,我们对细胞所富集的铁进行了有机化程度分析,研究结果显示,细胞所富集的铁中约有98%转化为有机铁。
3 结 论
   3.1 试验发现硫酸亚铁的添加对酵母菌的生长有一定的抑制作用,通过试验筛选出一株富铁能力较高的产朊假丝酵母菌株CRJ3,作为试验菌株。
   3.2 本试验综合考虑产朊假丝酵母的生长周期,不同pH下生长的情况,以及耐受铁的能力等,筛选出富铁酵母的最佳培养条件为:在500 ml三角瓶中装入75ml培养基,培养基起始pH值为5.0,所用的铁源为硫酸亚铁,铁浓度为800µg/mL,并且在初始培养基中即加入硫酸亚铁,按2%的接种量,培养时间为24h,在上述条件下进行发酵,生物量能达到1.30g/100mL,总铁含量能达到450mg/L以上,细胞中铁的含量能达到35mg/g以上。
   3.3 按上述条件,采用实验室发酵罐进行恒定pH发酵,所得酵母菌体生物量能达到1.45g/100mL以上,总铁含量能够达500mg/L左右,并且细胞所富集的铁中约有98%转化为有机铁,适合工业化规模生产。

参考文献
   [1] 李淑敏.酵母作为微量元素载体的研究及应用前景[J].微生物学通报,1 999,26(3):220~222.
   [2] 李卫平,秦翠霞.富铁牛乳的研究与开发[J].食品科技,2002,130(8):48~50.
   [3] Kim HJ,Kim JH,et al.Expression of heteropolymeric ferritin improves iron storage in Saccharomyces cerevisiae.Appl.Environ.Microbiol.2003,69:1999-2005.
   [4] Shin YM,Kwon TH,Kim KS,et al.Enhanced iron uptake of Saccharomyces cerevisiae by heterologous expression of a tadpole ferritin gene. Appl.Environ.Microbiol.2001,67:1280-1283.
   [5] 王利伟,钱爱东,林春艳,等.酵母富集微量元素铁的研究.中国微生态学杂志,2002,14:83-84.
   [6] Gaudreau H,Tompkins TA and Champagne CP.The distribution of iron in iron-enriched cells of Saccharomyces cerevisiae.Acta Alimentaria,2001,30:355-361.
   [7]陈阅增,张惟杰,罗大珍,等.微量元素营养剂的最佳形式[J].微量元素与健康研究,1987(1):5-l1.
   [8]李志东,李娜,张洪林,等.啤酒酵母吸附重金属离子铬的研究[J].中国酿造,2006(10):38-42.
   [9]谢丽琪,欧阳政,谢秀祯.酵母同化无机硒作用的研究[J].微生物学报,1990,30(1):36-40.
   [10] 许祯莹,陈代文,余冰.啤酒酵母富铁培养条件筛选[J].四川农业大学学报,2010,28(1):52.
   [11] 成都科学技术大学与浙江大学分析化学教研室,分析化学试验(第二版)[M].北京:高等教育出版社,1993:155-161.

 

选择客服

山东宝来利来生物工程股份有限公司 版权所有  管理员信箱:[email protected]
地 址:山东省泰安市高新技术产业开发区创业大街  电 话:05388078888 传 真:0538-8513252
鲁ICP备09032523号