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富锰酵母菌株的筛选及培养条件的优化
作者:   时间:2012-10-25

 


   孙合美 王静 谷巍
(山东宝来利来生物研究院,山东泰安,271000)

  摘要:本文通过对富锰酵母菌株的筛选、锰源的筛选及培养条件的优化,筛选出其适宜菌种为产朊假丝酵母(Candida utilis) 的紫外诱变菌株Cr38,最适发酵条件为:培养基中KH2PO4的添加量为0.2%,发酵培养基最适初始pH为5.0,500mL三角瓶装量50mL,培养温度为32℃,2%接种量,锰源为氯化锰,发酵初期在培养基中添加锰源,Mn2+添加浓度为350μg/mL,发酵时间为34h,对酵母的富集最有利。其生物量可达11.8g/L,锰富集量为108.6mg/L。
关键词:富锰酵母;筛选;发酵条件;优化
 
  Selecting and fermentation condition optimization of a manganese -enriched yeast strain
Abstract: The selected manganese-enriched yeast was Cr38 that Candida utilis treated with UV. Fermentation conditions were investigated.The optimized fermentation medium determined by single factor: KH2PO4 0.2%. The corresponding fermentation conditions were: initial pH 5, culture temperature 32℃, 50mL liquid medium in a flask of 500mL and inoculum concentration of 2%(v/v).The mineral Mn-source was MnCl2; it was added at beginning. its concentration of Mn2+ was 350μg/mL ; fermentation period was 34h;Under the optimized conditions,the biomass of manganese-enriched yeast was 11.8g/L; total manganese content was up to 108.6mg/L.
Key words: manganese-enriched yeast;breeding;fermentation condition;optimization 
 

  锰是动物体必需的微量元素之一,其与家禽的生长、骨骼的发育、蛋壳形成和正常生殖能力的维持等方面关系较为密切,动物缺锰时会出现生长停滞、骨骼畸形、生殖功能紊乱、产奶少、抽搐和运动失调等。
  微量元素氨基酸螯合物与维生素和抗生素等无配伍禁忌,容易保存,能抵抗干扰,不存在无机微量元素吸收上的竞争作用,还可提高动物免疫功能,缓解应激反应。因此,研制和开发在生物学活性和代谢上优于无机硫酸锰或氧化锰的有机锰,促进养殖业的高效和可持续发展,具有重要意义。
  本研究旨在探索酵母菌菌株富集锰离子的能力及影响因素,筛选高富锰量的酵母菌株及生产酵母锰的最佳培养条件,为工业大生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 产朊假丝酵母(Candida utilis):Cr、Cr11、Cr38、Cr28、Cr2;
   啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae):PJ、PJ35、PJ60;共8株。
   由山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种保藏中心保存。
1.1.2 培养基配方 酵母膏5g,蛋白胨10g,葡萄糖20g,KH2PO40.2g,蒸馏水1000mL,自然pH。
1.1.3 酵母生物量的测定 发酵液4000rpm离心5min,去上清液,沉淀以适量蒸馏水清洗3遍,酵母菌泥105℃烘干至恒重。
1.1.4 锰的测定方法 原子吸收光谱法。
1.2 方法
1.2.1 菌株的筛选 由产朊假丝酵母Cr、啤酒酵母PJ及其紫外诱变菌株Cr2、Cr11、Cr38、Cr28 、PJ35和PJ60共8株菌株中筛选生物量高,且富锰能力较强的菌株,进行下一步培养基优化试验。
1.2.2发酵条件优化
  比较不同锰源、不同锰离子浓度、加锰时间、接种量、装液量、发酵初始pH值、不同培养温度、KH2PO4的添加量对酵母生物量及锰富集量的影响,确定合适的发酵条件。
1.2.3 小型发酵罐生长曲线测定
  采用Cr38菌株在实验室7升机械搅拌发酵罐进行发酵。发酵罐装液量为5L,基础发酵培养基,发酵温度32℃,2%接种量,发酵培养基初始pH为5.0,培养基中加入Mn2+浓度为350µg/mL的氯化锰。试验初期每4h取样一次,20h之后每2h取样一次,测定生物量和酵母中的锰含量,绘制富锰酵母生长曲线及锰富集曲线。
2 结果与讨论
2.1 菌种的筛选
表1 菌株筛选结果

菌种
生物量g/L
锰含量µg/g
富集量mg/L
PJ35
5.4
5789.3
31.02
PJ60
5.8
5858.62
34.05
PJ
4.6
6851.7
31.85
Cr11
10.2
3932.59
40.21
Cr38
10.3
4650.5
47.70
Cr28
11.0
4119.96
45.51
Cr2
11.3
3990.83
45.26
Cr
12.2
3836.5
46.84
  由表1可知,PJ酵母及其紫外诱变菌株锰含量较高,但生物量较低;Cr虽生物量较高,锰含量较低;最终以锰富集量,Cr38在8株菌株中最高,Mn含量和生物量均较高,故选定产朊假丝酵母Cr38为候选菌株。
2.2 锰源的筛选
表2 锰源筛选结果
锰源
生物量g/L
锰含量µg/g
富集量mg/L
MnSO4•H2O
11.2
3631.74
40.67
MnCl2•4H2O
11.5
4081.87
46.81
  由表2可知,MnCl2•4H2O生物量无显著差异,但富集量较MnSO4•H2O高,故选定MnCl2•4H2O为以后试验锰源。
2.3 加锰时间对酵母生物量及富锰量的影响
表3加锰时间对酵母生物量及富锰量的影响
时间
Mn2+加入量μg/g
生物量g/L
锰含量μg/g
富集量mg/L
0h
240
10.47
5161.36
54.05
12h
240
12.00
2573.11
30.88
24h
240
12.71
-
-
0h+12h+24h
100+100+40
11.38
3827.92
43.56
  由表3可知,加锰时间对酵母的生物量有较大影响,接种前加入锰离子,酵母的生物量最低;接种12h加锰,生物量较高,但酵母中锰离子的富集量明显降低;接种24h时加锰,酵母生物量最高,但酵母细胞内检测不出锰;流加方式加锰,酵母中锰的含量较低,故最终确定接种前加锰离子。
2.4 不同培养温度试验
表4 培养温度对酵母生物量和酵母细胞内锰含量的影响
温度
生物量g/L
Mn富集量mg/L
Mn含量μg /g
28
9.97
38.59
3870.61
30
9.92
40.68
4099.14
32
10.00
45.10
4512.33
  由表4可知 ,发酵温度对富锰酵母生长的生物量影响不大。但对酵母细胞内锰含量影响较大,在32℃发酵时,生物量较高,酵母细胞内锰含量也较高。
2.5 接种量的确定
表5 接种量对酵母生物量和锰含量的影响
接种量(%)
生物量(g/L)
Mn富集量(mg/L)
Mn含量(μg /g)
2
10.1
50.92
5062.33
4
10.2
49.98
4922.46
6
10.1
49.71
4922.26
8
10.1
48.40
4800.76
10
10.2
47.13
4627.04
  从表5可知,接种量对锰酵母的生物量和酵母内的锰含量影响差异不显著,锰富集量以以接种量2%最高,故确定其最适接种量为2%。
2.6装液量试验
表6 装液量对生物量和酵母细胞内锰含量的影响
装液量mL /500mL
生物量g/L
富集量mg/L
锰含量μg/g
50
9.60
49.15
5117.26
75
8.06
40.09
4974.35
100
7.01
33.75
4817.45
150
5.59
26.65
4762.48
200
4.83
22.90
4737.17
300
4.16
19.59
4706.02
  由表6可知 ,装液量对富锰酵母的生长和富锰能力影响显著,装液量越少,则通气量越大,生物量及锰的富集量越多,试验中500mL三角瓶装液量50mL酵母细胞生物量和富锰量均较高。
2.7 发酵培养基初始pH对生物量和酵母富锰量的影响
表7发酵培养基初始 pH对富锰酵母的影响
pH
生物量g/L
锰含量µg/g
富集量mg/L
4.0
12.36
2180.50
26.96
4.5
11.95
2696.20
32.22
5.0
12.03
3530.74
42.46
5.5
11.72
3326.07
38.99
6.0
11.38
3299.61
37.55
6.5
11.18
3782.19
42.28
7.0
10.77
4552.56
49.04
  由表7可知,初始pH对富锰酵母的生长和富锰能力有较大影响。当初始pH5.0时生物量较高,其细胞内锰含量亦较高。因此,初始pH应控制在5.0为宜。
2.8 磷酸二氢钾对酵母富锰的影响
  磷酸盐在酵母灰分中约占44.8%-59.4%,其中磷是构成核酸、磷脂和许多辅酶的成分,并且参与碳水化合物的代谢。钾盐占酵母灰分的23.33%-39.50%,含量仅次于磷酸盐,虽不参与细胞组成,但它是许多酶的激活剂,还可控制细胞质的胶态和细胞膜的通透性。因而研究磷酸二氢钾的影响有重要意义。
由表8可知,基础培养基中不加KH2PO4时,酵母生物量最低;随着KH2PO4添加浓度的不断升高,酵母生物量呈上升趋势,KH2PO4添加浓度为0.2%时,锰含量最高;富集量在KH2PO4添加浓度为0.2~1.0%间时,锰富集量呈下降趋势,故最终确定KH2PO4的添加量为0.2%。
表8 磷酸二氢钾对酵母富锰的影响
KH2PO4浓度/%
生物量g/L
锰含量µg/g
富集量mg/L
0
8.74
4536.65
39.66
0.2
10.19
4810.82
49.01
0.5
10.37
4602.34
47.72
0.8
10.67
3867.31
41.25
1.0
10.67
3601.61
38.43
2.9 温度对酵母生物量及富锰量的影响
表9温度对酵母生物量及富锰量的影响
温度℃
生物量g/L
锰含量µg/g
富集量mg/L
28
9.97
3870.61
38.59
30
9.92
4099.14
40.68
32
10.00
4512.33
45.10
  由表9可知,在28~32℃范围时,酵母的生物量无显著差异,但锰含量及富集量为32℃最高,故最终确定为酵母的培养温度为32℃。
2.10 不同锰离子浓度对酵母富锰及转化率的影响
表10 不同锰离子浓度对酵母富锰及转化率的影响
Mn添加量(μg/mL)
生物量g/L
Mn含量(μg/g)
富集量mg/L
转化率%
200
10.8
4117.13
44.52
22.26
240
10.8
4787.70
51.91
21.63
260
10.6
5672.34
60.21
23.16
280
10.5
7086.16
74.56
26.63
300
10.7
6470.08
69.41
23.14
350
10.5
9131.32
95.47
27.28
400
9.8
8769.95
85.55
21.39
500
8.9
9714.28
86.13
17.23
800
2.1
14678.56
30.34
3.79
900
1.6
28545.42
44.78
4.98
  从表10可知,在Mn2+浓度200~350μg/mL范围内,随着Mn2+浓度的增加,酵母生物量无显著下降趋势,该产朊假丝酵母在此范围内具有较强的耐锰能力。但从Mn2+浓度400μg/mL开始,随Mn2+浓度的增加,生物量呈显著下降,锰元素的转化率也下降。故选择最佳Mn2+浓度为350μg/mL。
2.11 小型发酵罐发酵试验
图1 酵母小型发酵罐发酵曲线



由图1可知,发酵罐生产富锰酵母,其生物量在34h出现一次高峰,然后又下降,在44h达到最大12.97g/L,但在34h之后,酵母中锰含量变化较小,生物量及锰含量在34h已较大11.8g/L,锰富集量为108.6mg/L,考虑发酵成本,故发酵时间确定为34h。
3 结论
经对酵母的发酵条件优化试验,筛选出其适宜发酵条件为:500mL三角瓶装量50mL,培养温度为32℃,接种量2%,发酵培养基最适初始pH为5.0,锰源为氯化锰,最高锰离子浓度为350μg/mL,加锰方式为发酵前一次性加入,培养基中KH2PO4的添加量为0.2%对酵母的富集有利;最终富锰酵母的生物量为11.8g/L,锰富集量为108.6mg/L,为大规模生产富锰酵母提高理论依据。

参考文献
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